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上海纪宁实业有限公司 >>> 技术文献

纪宁生物:免疫荧光技术两种检测方法

点击次数:52 发布时间:2019-10-10

免疫荧光技术有两种检测方法:用荧光标记抗体示踪或检测相应抗原的方法称荧光抗体法;用已知的荧光标记抗原示踪或检测相应抗体的方法称荧光抗原法。其中以荧光抗体方法较常用。

 

1.在开始实验研究前,有哪些因素需要考虑?

答:1.根据抗原选择合适的抗体:确认抗原可以识别哪一种异构体以及抗原表位的位置。

2. 确认您的目的蛋白在该样本中是否表达(这里需要用到阳性对照)。

3. 根据您所要研究的目标蛋白来确定合适的样本类型(石蜡切片、冰冻切片还是细胞制备物等)。

4.选择抗体时需要考虑该抗体的物种交叉反应;

5. 关于蛋白,您需要考虑它的组织定位和细胞定位,以及染色时是否应该有信号。

6.选择合适的固定方法及抗原修复方法。

7.抗体的工作浓度或稀释比例,以及抗体的物种来源也是需要考虑的重要因素。

 

2.免疫组化实验里为什么要对样品进行处理?

答:样品处理是为了调控样本中蛋白的表达水平。
如果是细胞实验,我们可能需要使用适当的抑制剂或激活剂来上调或下调细胞中某种蛋白质的表达。如果是体内实验,我们需要考虑更多的因素,因为实验对象是活的实验动物。在选择抑制剂或激活剂、激动剂或拮抗剂时,应尽量避免由于非特异性结合其它蛋白所导致的非特异性效应。
对于某些特殊试验样品,比如脑,我们需要确保细胞的渗透性,让化合物能真正进入细胞或血脑屏障。另外需要确保所使用的化学品能够溶于合适的溶剂。还有确定*适合的给药途径(注射或口服)。完成上述所有步骤之后,您就可以获取组织或细胞样品了。

 

3.请问如何根据具体的实验对象来选择不同的样本形式呢?

答:对于细胞制备物,它们常见的形式是涂片或培养的细胞系。对于组织样本,*常用的是石蜡包埋的组织切片,福尔马林固定。原因是它们能够保持组织形态与蛋白抗原性之间的*佳平衡。石蜡包埋的组织切片很稳定,并且易于使用。但它的不足之处是很耗时(需要对切片进行脱蜡处理和抗原修复)。一般来说,石蜡切片适用于 4 微米厚的切片。如果切片厚度大于4微米,抗体可能会被困住,导致假阳性染色,这是我们需要避免的。


另一种常见的样本形式是冰冻组织切片(IHC-FR),这对于不能经受醛固定处理和石蜡处理的抗原来说非常理想。因此这些抗原将呈现出更天然的状态。但冰冻切片的缺点是组织形态可能不佳,与石蜡切片相比,冰冻切片可能没那么好看。冷冻切片通常也仅适用于厚度为 4 到 10 微米的薄切片,超过这个厚度的切片可能会困住抗原,导致假阳性染色结果。

 

如果您所要研究的组织类型无法做成这种厚度的薄切片,可以考虑采用漂片。该技术一般用于脑组织和脊髓,在发育研究中,这是一项非常有用的技术。该技术可用于厚度达 40 微米的更大切片。它的缺点是操作起来更加不便,整个过程中组织样品都处于自由漂浮状态,*后还必须将它们固定在载玻片上进行观察,操作有一定的难度。它的另一个缺点就是非常耗时,尤其是应用于神经科学研究时,动物用 BFA 灌注,这显然也是有难度的一步。

 
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