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上海纪宁实业有限公司 >>> 技术文献

大鼠骨骼肌细胞培养方法

点击次数:137 发布时间:2020-01-03

一、原代培养法
1.将重生大鼠用颈椎脱位法处死,qu除足趾及尾巴。70%酒精消毒后固定于解剖板上。
2.去除后腿皮肤,用血管钳别离并剪切大腿肌肉。用含抗生素(青霉素100IU/ml、链霉素100μg/ml)的PBS冲洗2次。
3.将肌肉组织放人装有用D—Hanks液制造的0.25%的胰蛋白酶溶液瓶中。瓶中预先放人一个磁棒,37℃(或室温)磁力搅拌器上消化屡次,每次10min。
4.使用沉淀法搜集上清液中悬浮的细胞,未消化部分可继续用同样办法消化。
5.向细胞悬液中参加终浓度为10%的马血清,停止胰蛋白酶消化作用。2500~3000r/min离心3~5min,用少量的培育液重新悬浮细胞,钢网过滤细胞悬液。
6.计数悬液细胞数。调制细胞浓度为1 X 106/ml。
7.接种细胞时,按60mm培育皿接种2~3×106细胞数为宜。37℃、5%CO2孵箱培育。

二、骨骼肌细胞的克隆化培养
1.明胶处理培育皿,将明胶覆盖于培育皿一层即可。
2.制备养殖细胞将养殖细胞(可为鼠传代细胞,或其他细胞)经60GyX线照射后,以0.5~l×105个/皿铺于培育皿。
3.将原代或传代培育的骨骼肌细胞计数并进行有限稀释,每培育皿接种25~100个细胞。在适宜的条件下,细胞增殖一代的时刻为11~13h。一般在培育3~6d开端构成克隆。在无养殖层细胞时亦可构成克隆,但易受培育条件影响而降低克隆构成率。
4.单一克隆别离及传代,先以蜡笔标记出显微镜下观察到的克隆,吸去培育液,以克隆环套住克隆并以硅脂封闭。向环中加l滴0.25%胰蛋白酶溶液。数分钟后吸出细胞悬液,接种到新的培育板上。从原代培育的细胞取得的克隆通常可传1~2代,但肌源性细胞株则易于进行连续传代,可克隆屡次。

三、骨骼肌细胞纯化
骨骼肌细胞的贴壁速度比非肌源性细胞慢,为此,可以用差速贴壁法取得较高纯度的肌源性细胞。具体办法是:
1.取原代培育早期的细胞(培育30~40h),经洗刷后,用0.25%的胰蛋白酶溶液消化。细胞开端脱壁时以马血清停止消化。
2.搜集脱壁的细胞,洗刷后用培育液制备成细胞悬液。
3.当即接种到另一培育板上,贴壁40min。此时,大都非肌源性细胞现已贴壁,而骨骼肌细胞仍悬浮在培育液中,或沉降到培育板上但未贴壁。
4.吸出未贴壁细胞,计数后将细胞调至所需细胞浓度,进行接种。
5.接种后,骨骼肌细胞纯度可到达90%以上。该办法亦可用于直接经胰蛋白酶溶液消化的肌肉组织细胞。

四、结果观察
在接种后数小时,大都细胞即可贴附至培育瓶(皿)。培育瓶中首要应为单个核的肌细胞.梭形、折光性较强可与非肌源性细胞相辨别。接种培育约50h后,可见显着细胞交融,并能构成纤维网。数天后细胞交融停止。交融后ld可见肌纤维的自发性收缩,l~2d后骨骼肌细胞的特征性横纹变得显着。使用放射自显影、细胞化学及生物化学等办法可分析与交融有关的细胞合成活动的变化。

五、冷冻保存
骨骼肌细胞也可以用冷冻保存的方式长期保种。
1.将肌细胞消化后配成约106个/ml的细胞悬液,用含20%马血清,12%DMSO的细胞培育液制造,每个2ml的冻存管中参加lml细胞悬液,做好标记。
2.先将冻存管置于4℃数小时,放于一20℃数小时。放在经4℃预冷的壁厚lcm以上的泡沫塑料盒内,置于80℃低温冰箱中,使冻存管到达缓慢制冷的作用。l~2d后.可将冻存管放人液氮中长期保存。
3.解冻时,将冻存管从液氮罐中取出,当即放人37℃水浴中敏捷解冻。台式离心机离心1500 r/min。然后吸去上清液,以新鲜培育液稀释细胞沉淀,接种培育于培育皿或培育瓶中。也可不离心,直接将细胞悬液接种至培育瓶中,加培育液进行培育。细胞贴壁后可按常复办法换液。

 
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