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上海纪宁实业有限公司 >>> 技术文献

纪宁解析:免疫组化方法的优点和缺点

点击次数:47 发布时间:2020-01-17

一、免疫安排化学染色方法
1、按符号物质的种类,如荧光染料、放射性同位素、酶(首要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)、铁蛋白、胶体金等,可分为免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和免疫金银法等。
2、按染色步骤可分为直接法(又称一步法)和间接法(二步、三步或多步法);与直接法比较,间接法的灵敏度提高了许多。
 

3、按结合办法可分为抗原—抗体结合,如过氧化物酶-抗过氧化物酶(PAP)法和亲和连接,如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC)法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结(SP)法等,其间SP法是zui常用的办法。


二、免疫组化技能的基本原理

使用免疫学及安排化学原理,对安排切片或细胞标本中的某些化学成分进行原位的定性、定位或定量研讨,这种技能称为免疫安排化学技能或免疫细胞化学技能。
 

众所周知,抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是运用这一特性,即先将安排或细胞中的某些化学物质提取出来,以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等试验动物,制备特异性抗体,再用这种抗体(*抗体)作为抗原去免疫动物制备第二抗体,并用某种酶(常用辣根过氧化物酶)或生物素等处理后再与前述抗原成分结合,将抗原扩大,因为抗体与抗原结合后构成的免疫复合物是无色的,因此,还必须借助于安排化学办法将抗原抗体反响部位显现出来(常用显色剂DAB显现为棕黄色颗粒)。

 

通过抗原抗体反响及呈色反响,显现细胞或安排中的化学成分,在显微镜下可清晰看见细胞内发作的抗原抗体反响产品,然后能够在细胞或安排原位确认某些化学成分的散布、含量。安排或细胞中但凡能作抗原或半抗原的物质,如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。​

 

三、几种常用免疫安排化学办法的原理

1、免疫荧光方法
是zui早树立的免疫安排化学技能。它运用抗原抗体特异性结合的原理,先将已知抗体标上荧光素,以此作为探针检查细胞或安排内的相应抗原,在荧光显微镜下调查。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出必定波长的荧光,然后可确认安排中某种抗原的定位,从而还可进行定量分析。因为免疫荧光技能特异性强、灵敏度高、快速简便,所以在临床病理诊断、检验中使用比较广。

 

2、免疫酶标方法

免疫酶标办法是继免疫荧光后,于60年代发展起来的技能。基本原理是先以酶符号的抗体与安排或细胞效果,然后参加酶的底物,生成有色的不溶性产品或具有必定电子密度的颗粒,通过光镜或电镜,对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研讨。免疫酶标技能是现在zui常用的技能。
本办法与免疫荧光技能比较的首要长处是:定位精确,对比度好,染色标本可长期保存,合适于光、电镜研讨等。
免疫酶标办法的发展非常迅速,已经衍生出了多种符号办法,且跟着办法的不断改进和创新,其特异性和灵敏度都在不断提高,运用也越来越便利。现在在病理诊断中广为运用的当属PAP法、ABC法、SP法等。

 

3、免疫胶体金技能

免疫胶体金技能是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为符号物。胶体金是指金的水溶胶,它能迅速而稳定地吸附蛋白,对蛋白的生物学活性则没有显着的影响。因此,用胶体金符号一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作为探针,就能对安排或细胞内的抗原进行定性、定位,乃至定量研讨。因为胶体金有不同巨细的颗粒,且胶体金的电子密度高,所以免疫胶体金技能特别合适于免疫电镜的单符号或多符号定位研讨。因为胶体金自身呈淡至深赤色,因此也合适进行光镜调查。如使用银加强的免疫金银规律更便于光镜调查。

 

四、免疫组化技能的优点

1、特异性强 

免疫学的基本原理决定了抗原与抗体之间的结合具有高度特异性,因此,免疫组化从理论上讲也是安排细胞中抗原的特定显现,如角蛋白(keratin)显现上皮成分,LCA显现淋巴细胞成分。只要当安排细胞中存在交叉抗原时才会呈现交叉反响。

 

2、敏感性高 

在使用免疫组化的开始阶段,因为技能上的约束,只要直接法、间接法等敏感性不高的技能,那时的抗体只能稀释几倍、几十倍;现在因为ABC法或SP法的呈现,使抗体稀释上千倍、上万倍乃至上亿倍仍可在安排细胞中与抗原结合,这样高敏感性的抗体抗原反响,使免疫组化办法越来越便利地使用于常规病理诊断工作。

 

3、定位精确、形状与功用相结合 

该技能通过抗原抗体反响及呈色反响,可在安排和细胞中进行抗原的精确认位,因此可一起对不同抗原在同一安排或细胞中进行定位调查,这样就可以进行形状与功用相结合的研讨,对病理学研讨的深入是非常有意义的。

 
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